银杏内酯对培养的皮层神经元的影响及机制

 摘　要:
目的：探讨银杏内酯（Gin）对体外培养的皮层神经元的影响及机制。方法：用Gin处理皮层神经元，以细胞活性、丙二醛（MDA）含量、促红细胞生成素（EPO）的表达为指标。结果：经Gin处理的神经元，胞体饱满，突起变粗变长，细胞活性明显升高，MDA含量降低，EPO表达显著上升。结论：Gin对神经元生长有营养保护作用，其机制可能与提高神经元EPO表达水平，增强神经元抗氧化能力有关。

 关键词:银杏内酯 神经元 丙二醛 促红细胞生成素

 银杏内酯(Ginkgolides，Gin1是银杏叶提取物的主要 活性成分之一，已分离出GinA、B、C、M、J，其中Gin B是 血小板活化因子(PAF)受体强拮抗剂【】1。研究表明，Gin终 浓度为37．5txg／rrd时，对原代培养的皮层神经元缺氧损伤 有很好的保护作用[21，但对正常培养的神经元的影响及其 机制，很少有报道。本研究旨在观察Gin对正常培养的皮 层神经元活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的影 响，并探讨其机制，为临床应用开发提供理论依据。

 1 材料与方法

 1．1 材料ICR小鼠(南通大学实验动物中心提供)， DMEM 培养基(GIBCO公司)，L一多聚赖氨酸、胰蛋白酶 (SIGMA公司)，抗EPO多克隆抗体(Santa Cruz Biotech． nology公司)，抗[3-actin单克隆抗体(SIGMA公司)，辣根 过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠和羊抗兔IgG(Pierce公 司)，Gin(中国药科大学提供，批号：991 122)。

 1．2 方法

 1．2．1 神经元活性和MDA含量的测定：取胎龄13 15d的 ICR小鼠，参照文献P-I进行皮层神经元的分离和培养，用 MTT法检测细胞活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量回。

 1．2．2 蛋白质免疫印迹(Western Blot方法)：各组细胞移去培养基，用预冷的PBS洗2遍，置于冰台上，按文献方 法【3】裂解细胞，测定蛋白含量，采用SDS—PAGE电泳分离 系统，检测促红细胞生成素(EPO)的表达，每孔上样6 0 g总蛋白。

 2 结果

 2．1 Gin对神经元形态和活性的影响 Gin组(37．5 ml Gin作用24h)，神经元胞体饱满，光晕明显，突起变粗 变长， 相互间连接成更复杂的网络结构(见图1，bar= 201xm)；与对照组比较，Gin组的神经元活性明显升高 (121±2．7％，P<0．05，n=10)。

 2．2 Gin对神经元MDA含量的影响 正常对照组皮层 神经元MDA含量为(3．064+0．143)nmol／mg protein，Gin组 为(2．712+0．162)nmol／mg protein，与对照组相比MDA含 量明显下降，有统计学差异(P<0．05)。

 2．3 Gin对神经元EPO表达的影响在正常情况下，用 EPO抗体作为一抗，在34kD处可检测到一条极微弱的条 带，但经Gin处理的神经元EPO蛋白表达明显升高 见图2)。

 3 讨论

 本研究表明，Gin提高了体外培养的皮层神经元活 性，提示Gin对神经元生长具有营养、保护作用，形态学 观察也证明了这一点。

 由于中枢神经系统不饱和脂肪酸含量丰富。容易导 致脂质过氧化，直接影响神经细胞的功能。为了探讨Gin 对神经元生长影响的机制。我们检测了神经元内脂质过 氧化产物MDA含量。结果显示Gin使正常培养的皮层神 经元MDA含量降低，说明Gin具有明显地提高神经元抗 氧化的能力。

 EPO是一种相对分子质量为34kD的糖蛋白。其生物学 作用主要是促进红细胞生成。近年证实，EPO具有非常广泛 的作用，在正常脑组织和缺血脑组织中都有一定量的EPO 及其受体表达。在缺氧缺血性脑损伤中发挥抗细胞凋亡、抗自由基、抗氧化和神经营养作用问。本研究显示，Gin提高了皮 层神经元EPO的表达，提示Gin可能通过刺激神经元高表 达EPO而提高神经元的抗氧化能力，从而达到保护神经元 生长的作用。但其具体的信号通路还有待进一步的研究。